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RT-qPCRおよびPCRのプライマー配列\n\n| 標的 | 配列 |\n|---|---|\n| ACTB forward | CCTCGCCTTTGCCGATCC |\n| ACTB reverse | GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC |\n| GAPDH forward | CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC |\n| GAPDH reverse | TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC |\n| LINE-1 forward | TAACCAATACAGAGAAGTGC |\n| LINE-1 reverse | GATAATATCCTGCAGAGTGT |\n| BNT162b2 forward | CGAGGTGGCCAAGAATCTGA |\n| BNT162b2 reverse | TAGGCTAAGCGTTTTGAGCTG |\n\n### 2.3. 免疫蛍光染色および共焦点イメージング\n\nHuh7細胞を、8チャンバースライド（LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, USA）に40,000細胞/ウェルの密度で播種し、BNT162b2（0.5、1または2 µg/mL）の存在下または非存在下で6時間培養した。免疫組織化学は、一次抗体として抗LINE-1 ORF1pマウスモノクローナル抗体（Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, USA）、二次抗体としてCy3 Donkey anti-mouse（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA）、およびHoechst（Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, USA）を用い、Thermo Fisher（Waltham, MA, USA）のプロトコルに従って実施した。各条件につき2枚の画像を、Zeiss LSM 800および63倍油浸対物レンズを用いて取得し、染色強度はImageJ 1.53cを用いて、画像ごとに15細胞について細胞全体領域および核領域で定量した。細胞質におけるLINE-1染色強度は、細胞全体の強度から核の強度を差し引くことで算出した。すべての細胞画像には、バイアスを防ぐためランダム番号を割り当てた。核（Hoechst染色によって判定）および細胞全体（LINE-1蛍光の境界によって判定）のマーキングには、Freehand selection toolを使用した。その後、これらの領域を測定し、平均強度を用いて群間比較を行った。\n\n### 2.4. ゲノムDNA精製、PCR増幅、アガロースゲル精製、およびサンガーシーケンシング\n\nゲノムDNAは、以前に記載されたプロトコル[32]に従い、PBND buffer（10 mM Tris-HCl pH 8.3、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2、0.45% NP-40、0.45% Tween-20）を用いて細胞ペレットから抽出した。DNA調製物から残存RNAを除去するために、RNase（100 µg/mL、Qiagen, Hilden, Germany）をDNA調製物に添加し、37℃で3時間インキュベートした後、95℃で5分処理した。その後、表1に示した配列を持つBNT162b2を標的とするプライマーを用いてPCRを実施し、以下のプログラムを用いた：95℃で5分、95℃で30秒、58℃で30秒、72℃で1分を35サイクル、最後に72℃で5分、12℃で5分。PCR産物は1.4%（w/v）アガロースゲル上で泳動した。予想サイズ（444 bp）のアンプリコンに対応するバンドを切り出し、製造元の指示に従い、QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen, 28104, Hilden, Germany）を用いてDNAを抽出した。DNAアンプリコンの配列は、サンガーシーケンシング（Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany）によって確認した。\n\n### 統計\n\n統計比較は、両側Studentのt検定およびANOVAを用いて行った。データは平均 ± SEMまたは ± SDで表した。p < 0.05の差を有意とみなした。\n\n### 2.5. 倫理声明\n\nHuh7細胞株は、日本バイオリソース研究資源センター（JCRB）Cell Bankから取得した。\n\n## 3. 結果\n\n### 3.1. BNT162b2は高効率でヒト肝細胞株Huh7細胞へ侵入する\n\nBNT162b2がヒト肝細胞へ侵入するかどうかを確認するために、ヒト肝細胞株Huh7をBNT162b2に曝露した。Huh7細胞におけるLNP送達の取り込み動態に関する以前の研究では、LNPの最大生物学的効果は4〜7時間の間に観察された[33]。したがって、本研究では、Huh7細胞を、BNT162b2の濃度を増加させた条件（0.5、1.0および2.0 µg/mL）または非存在下で、6、24、および48時間培養した。細胞からRNAを抽出し、図1に示すように、BNT162b2配列を標的とするプライマーを用いてリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）を実施した。BNT162b2の全配列は公に利用可能であり[34]、2ヌクレオチドのキャップ、ヒトαグロビン遺伝子の5′-UTRを組み込んだ5′非翻訳領域（UTR）、2つのプロリン変異を有するSARS-CoV-2 Sタンパク質全長、2つのC→U変異を有するヒトミトコンドリア12S rRNA（mtRNR1）セグメントおよびヒトAES/TLE5遺伝子セグメントを組み込んだ3′-UTR、poly(A) tailを含んでいる。BNT162b2におけるSタンパク質配列の詳細解析により、ヒトゲノム配列と100%同一である124個の配列、および19〜26 nt中1ヌクレオチド（nt）のみが不一致である3個の配列が明らかとなった（表S1、Supplementary Materials参照）。BNT162b2 RNAレベルを検出するために、我々はSARS-CoV-2 Sタンパク質領域に位置するforward primerと、3′-UTRに位置するreverse primerを設計した。これにより、ヒトゲノム領域への非特異的結合なしに、BNT162b2に特異的なPCRアンプリコンを検出することが可能となる。\n\nRT-qPCRの結果、BNT162b2で処理したHuh7細胞は、6、24、および48時間において、ハウスキーピング遺伝子と比較して高レベルのBNT162b2 mRNAを有していた（図2、極めて高レベルであったためlogged 2−ΔΔCTで表示）。3つのBNT162b2濃度は、48時間において1.0 µg/mLと2.0 µg/mLの間に有意差が認められたことを除き、異なる時点で類似した細胞内BNT162b2 mRNAレベルをもたらした。BNT162b2 mRNAレベルは、6時間と比較して24時間で有意に低下したが、48時間で再び増加した。\n\n**図1.** BNT162b2のmRNAレベルおよび逆転写を検出するために使用したPCRプライマーセット。BNT162b2の模式図は、以前に記載された文献[34]をもとに作成した。\n\n**図2.** BNT162b2で処理したHuh7細胞におけるBNT162b2 mRNAレベル。Huh7細胞を、BNT162b2非存在下（Ctrl）または0.5（V1）、1（V2）、および2 µg/mL（V3）のBNT162b2存在下で、6時間（緑色ドット）、24時間（オレンジ色ドット）、48時間（青色ドット）培養した。RNAを精製し、BNT162b2を標的とするプライマーを用いてqPCRを行った。BNT162b2 RNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびACTBに対するlogged 2−ΔΔCT値として表示した。結果は5回の独立実験による（n = 5）。各群間の差は両側Studentのt検定を用いて解析した。データは平均 ± SEMで表した。（* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001：各時点における対応する対照群との比較、または図中に示した比較）。\n\n### 3.2. ヒト内因性逆転写酵素 Long Interspersed Nuclear Element-1（LINE-1）に対するBNT162b2の影響\n\nここでは、LINE-1遺伝子発現に対するBNT162b2の影響を検討した。BNT162b2（0、0.5、1.0、および2.0 µg/mL）で6、24、および48時間処理したHuh7細胞から精製したRNAに対して、LINE-1を標的とするプライマーを用いてRT-qPCRを実施した。対照群と比較して有意に増加したLINE-1発現は、6時間時点において2.0 µg/mLのBNT162b2によって観察された一方で、より低濃度のBNT162b2では、すべての時点でLINE-1発現が低下した（図3）。\n\n**図3.** BNT162b2で処理したHuh7細胞におけるLINE-1 mRNAレベル。Huh7細胞を、BNT162b2非存在下（Ctrl）または0.5（V1）、1（V2）、および2 µg/mL（V3）のBNT162b2存在下で、6時間（緑色ドット）、24時間（赤色ドット）、48時間（青色ドット）培養した。RNAを精製し、LINE-1を標的とするプライマーを用いてqPCRを行った。LINE-1 RNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびACTBに対する2−ΔΔCT値として表示した。結果は5回の独立実験による（n = 5）。各群間の差は両側Studentのt検定を用いて解析した。データは平均 ± SEMで表した。（* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001：各時点における対応する対照群との比較、または図中に示した比較；† p < 0.05：6時間Ctrlとの比較）。\n\nfileciteturn0file0\n\n次に、LINE-1タンパク質レベルに対するBNT162b2の影響を検討した。全長LINE-1は、5′ untranslated region（UTR）、2つのopen reading frame（ORF）、すなわちORF1およびORF2、ならびに3′UTRから構成されており、このうちORF1はシャペロン活性を有するRNA結合タンパク質である。LINE-1のレトロトランスポジション活性には、ORF1の核への移行が関与することが示されている[35]。BNT162b2（0.5、1.0および2.0 µg/mL）存在下または非存在下で6時間処理したHuh7細胞を固定し、LINE-1 ORF1pに結合する抗体および細胞核可視化のためのDNA特異的プローブHoechstで染色した（図4a）。免疫蛍光染色強度の定量により、BNT162b2は、検討したすべての濃度において、細胞全体領域および核の両方でLINE-1 ORF1pタンパク質レベルを増加させることが示された（図4b–d）。\n\n**図4.** BNT162b2で処理したHuh7細胞におけるLINE-1タンパク質分布の免疫組織化学。Huh7細胞を、BNT162b2非存在下（Ctrl）または0.5、1、および2 µg/mLのBNT162b2存在下で6時間処理した。細胞を固定し、LINE-1 ORF1pに結合する抗体（赤色）および細胞核可視化のためのDNA特異的プローブHoechst（青色）で染色した。(a) BNT162b2存在下または非存在下で処理したHuh7細胞におけるLINE-1発現の代表画像。(b–d) 細胞全体領域(b)、細胞質(c)、および核(d)におけるLINE-1タンパク質の定量。すべてのデータはOne-Way ANOVAを用いて解析し、グラフはGraphPad Prism V 9.2を用いて作成した。すべてのデータは平均 ± SDで表示した（** p < 0.01、*** p < 0.001、**** p < 0.0001：図中に示した比較）。\n\n### 3.3. Huh7細胞における逆転写されたBNT162b2 DNAの検出\n\n以前の研究では、LINE-1タンパク質の核内移行がレトロトランスポジションと関連していることが示されている[35]。上述した免疫蛍光染色実験では、BNT162b2の最も低い濃度（0.5 µg/mL）においてすでに核内LINE-1レベルの上昇が観察された。LINE-1が上昇した際にBNT162b2がDNAへ逆転写されるかどうかを検討するために、0.5 µg/mLのBNT162b2で6、24、および48時間処理したHuh7細胞からゲノムDNAを精製した。精製DNAはRNA除去のためRNase処理を行い、図1に示したようにBNT162b2を標的とするプライマーを用いてPCRに供した。増幅されたDNA断片は電気泳動により可視化し、ゲル精製を行った（図5）。BNT162b2 DNAアンプリコンは、3つすべての時点（6、24、および48時間）で検出された。サンガーシーケンシングにより、DNAアンプリコンが、プライマーで挟まれたBNT162b2配列と同一であることが確認された（表2）。DNAアンプリコンがBNT162b2 RNAではなくDNA由来であることを確認するために、0.5 µg/mL BNT162b2で6時間処理したHuh7細胞から精製したRNAについても、RNase処理あり・なしでPCRを実施した（図5のCtrl 5および6）。その結果、PCRに供したRNAサンプルではアンプリコンは検出されなかった。\n\n**図5.** BNT162b2で処理したHuh7細胞におけるBNT162b2 DNAアンプリコンの検出。Huh7細胞を、BNT162b2非存在下（Ctrl）または0.5 µg/mLのBNT162b2存在下で、6、24、および48時間処理した。ゲノムDNAを精製し、100 µg/mL RNaseで消化した。図1および表1に示したBNT162b2を標的とするプライマーを用いて、すべてのサンプルに対してPCRを行った。DNAアンプリコン（444 bp）はアガロースゲル上で可視化した。BNT：BNT162b2；L：DNA ladder；Ctrl1：培養したHuh7細胞；Ctrl2：6時間時点で回収したBNT162b2未処理Huh7細胞；Ctrl3：24時間時点で回収したBNT162b2未処理Huh7細胞；Ctrl4：48時間時点で回収したBNT162b2未処理Huh7細胞；Ctrl5：0.5 µg/mLのBNT162b2で6時間処理したHuh7細胞由来RNA；Ctrl6：0.5 µg/mLのBNT162b2で6時間処理したHuh7細胞由来RNAをRNase消化したもの。\n\n### 表2. BNT162b2アンプリコンのサンガーシーケンシング結果\n\nCGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGT\nACGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTGATTG\nCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGG\nGCTGTTGTAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTGA\nAGGGCGTGAAACTGCACTACACATGATGACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTA\nGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGC\nTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGC\nAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTA\n\n## 4. 考察\n\n本研究では、COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2が、in vitroにおいてヒト肝細胞株Huh7へ侵入可能であることを示す証拠を提示する。BNT162b2 mRNAは、BNT162b2曝露後わずか6時間で細胞内においてDNAへ逆転写される。逆転写の可能な機序としては、内因性逆転写酵素LINE-1が考えられ、LINE-1の核内タンパク質分布はBNT162b2によって上昇する。\n\n肝細胞におけるLNPの細胞内蓄積は、in vivoで実証されている[36]。BNT162b2に関する前臨床研究では、BNT162b2がヒト細胞株HEK293Tへ侵入し、BNT162b2抗原の強力な発現を引き起こすことが示された[37]。したがって、本研究ではまず、ヒト肝細胞株Huh7細胞へのBNT162b2侵入を調査した。本研究で使用したBNT162b2濃度の選択については説明が必要である。BNT162b2は、3週間隔で2回投与され、各回の投与には0.3 mL中に30 µgのBNT162b2が含まれる。これは、注射部位における局所濃度が最大100 µg/mLであることを意味する[31]。類似のLNP送達システムを用いたH10N8およびH7N9インフルエンザウイルスに対するmRNAワクチンの以前の研究では、mRNAワクチンが肝臓、脾臓、心臓、腎臓、肺、および脳など複数の臓器へ比較的非特異的に分布し、肝臓での濃度は筋肉内注射部位の約100分の1であることが示された[38]。PfizerがEMAに提出したBNT162b2の評価報告書では、ラットにおける薬物動態分布試験により、総投与量の比較的大きな割合（最大18%）が肝臓に分布することが示された[26]。したがって、我々は肝細胞実験において、0.5、1、および2 µg/mLのワクチン濃度を選択した。しかし、より広範囲の低濃度および高濃度のBNT162b2による影響についても、将来の研究で検証されるべきである。\n\n本研究では、in vitro検討のためにヒト肝細胞株を用いた。肝細胞がワクチン由来のSARS-CoV-2スパイクタンパク質も提示するかどうかを検討する価値がある。これは、以前にプライミングされたスパイクタンパク質反応性細胞傷害性T細胞の標的となる可能性があるためである。BNT162b2接種後に自己免疫性肝炎を発症した症例報告も存在する[39]。BNT162b2が肝機能に及ぼしうる影響をよりよく理解するためには、将来的にin vivoモデルが望まれる。\n\nBNT162b2毒性報告書では、遺伝毒性試験も発がん性試験も提示されていない[26]。本研究は、BNT162b2が肝細胞株Huh7においてDNAへ逆転写されうることを示しており、これにより、BNT162b2由来DNAが宿主ゲノムへ組み込まれ、ゲノムDNAの完全性に影響しうるのではないかという懸念が生じる。これは潜在的に遺伝毒性の副作用を媒介する可能性がある。現段階では、BNT162b2から逆転写されたDNAが細胞ゲノムへ組み込まれるかどうかは不明である。BNT162b2がゲノム完全性に及ぼす影響を明らかにするためには、BNT162b2に曝露した細胞の全ゲノムシーケンシングや、BNT162b2接種を受けたヒト被験者由来組織を含む、さらなる研究が必要である。\n\nヒト自律型レトロトランスポゾンLINE-1は、細胞内因性逆転写酵素であり、ヒトに残された唯一の活性トランスポゾンである。それ自体および他の非自律型要素をレトロトランスポーズすることができる[40,41]。ヒトゲノムの約17%はLINE-1配列から構成されている[42]。非自律型Alu要素、short interspersed nucleotide elements（SINEs）、variable-number-of-tandem-repeats（VNTR）、および細胞性mRNA加工偽遺伝子は、transに作用するLINE-1レトロトランスポジションタンパク質によってレトロトランスポーズされる[43,44]。最近の研究では、内因性LINE-1が、感染したヒト細胞ゲノムへのSARS-CoV-2配列の逆転写および組み込みを媒介することが示された[25]。さらに、内因性LINE-1の発現は、SARS-CoV-2感染を含むウイルス感染時にしばしば増加する[45–47]。以前の研究では、LINE-1レトロトランスポジション活性は、RNA代謝[48,49]、DNA損傷応答[50]、およびオートファジー[51]によって調節されることが示されている。LINE-1の効率的なレトロトランスポジションは、細胞周期および有糸分裂時の核膜崩壊[52,53]、ならびに外因性レトロウイルス[54,55]と関連しており、これらはLINE-1の核内侵入を促進する。我々の研究では、免疫組織化学により、検討したすべての濃度（0.5、1、および2 µg/mL）において、BNT162b2による核内LINE-1 ORF1p分布の増加を観察した。一方、LINE-1遺伝子発現の上昇は、最も高いBNT162b2濃度（2 µg/mL）で検出された。注目すべき点として、遺伝子転写はクロマチン修飾、転写因子制御、およびRNA分解速度によって調節される一方、タンパク質翻訳の調節には、開始コドンへのリボソーム動員、ペプチド伸長の調節、タンパク質合成終結、またはリボソーム生合成が関与する。これら2つの過程は異なる機構によって制御されるため、外的刺激に対して常に同じ変化パターンを示すとは限らない。BNT162b2に応答したLINE-1活性の正確な調節機構については、さらなる研究が必要である。\n\nfileciteturn0file0\n\n本研究で使用した細胞モデルは、DNA複製が活発な癌細胞株であり、分裂しない体細胞とは異なる。また、Huh7細胞は、RNA代謝に関与するタンパク質の発現上昇を含め、遺伝子およびタンパク質発現が有意に異なることも示されている[56]。しかし、骨髄、上皮の基底層、あるいは胚発生中など、ヒトの複数の組織では細胞増殖が活発であるため、そのような条件下におけるBNT162b2のゲノム完全性への影響を検討する必要がある。さらに、LINE-1の効率的なレトロトランスポジションは、ヒト神経細胞のような非分裂性かつ終末分化した細胞においても報告されている[57,58]。\n\nPfizer EMA評価報告書では、BNT162b2が脾臓（<1.1%）、副腎（<0.1%）、ならびに卵巣および精巣において低いながらも測定可能な放射活性（<0.1%）を示すことも示された[26]。さらに、Pfizer EMA評価報告書には、BNT162b2の胎盤通過に関するデータは存在しない。我々の結果は、BNT162b2 mRNAが、注射部位局所濃度の0.5%に相当する濃度（0.5 µg/mL）で容易にHuh7細胞へ侵入し、LINE-1遺伝子およびタンパク質発現の変化を誘導し、6時間以内にBNT162b2の逆転写が検出可能であることを示した。したがって、BNT162b2が他の細胞型および組織に及ぼす影響について、in vitroおよびin vivoの両方でさらに調査することが重要である。\n\n## 5. 結論\n\n本研究は、COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2がヒト肝細胞株に及ぼす影響に関する最初のin vitro研究である。我々は、BNT162b2が細胞内へ迅速に侵入し、その後BNT162b2 mRNAが細胞内でDNAへ逆転写されることを示す証拠を提示した。\n\n## Supplementary Materials\n\n以下の補足情報は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/cimb44030073/s1 からダウンロード可能である。\n\n## Author Contributions\n\nM.A.、F.O.F.、D.Y.、M.B.およびC.L.はin vitro実験を実施した。M.A.およびF.O.F.はデータ解析を行った。M.R.およびY.D.M.は研究の実施に寄与し、研究を設計および監督した。Y.D.M.は、全著者からの入力を得て論文を執筆した。すべての著者は、出版版原稿を読み、承認した。\n\n## Funding\n\n本研究は、Swedish Research Council、Strategic Research Area Exodiab、Dnr 2009-1039、Swedish Government Fund for Clinical Research（ALF）、およびSkåne University Hospital foundationの支援を受けた。\n\n## Institutional Review Board Statement\n\n該当なし。\n\n## Informed Consent Statement\n\n該当なし。\n\n## Data Availability Statement\n\n本研究の結果を支持するすべてのデータは、本論文および補足情報内で利用可能である。\n\n## Acknowledgments\n\n著者らは、本研究への支援に対し、Sven Haidl、Maria Josephson、Enming Zhang、Jia-Yi Li、Caroline Haikal、およびPradeep Bompadaに感謝する。\n\n## Conflicts of Interest\n\n著者らは利益相反がないことを宣言する。\n\n## References\n\n1. 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Bnt162b2 肝細胞逆転写論文 日本語逐語訳 第1回

Bnt162b2 肝細胞逆転写論文日本語逐語訳第1回